據(jù)蔡司電子顯微鏡君了解早在32億年前，微生物就出現(xiàn)在了地球上，近年來這一與人類健康息息相關(guān)的研究領(lǐng)域愈發(fā)活躍。隨著熒光標(biāo)記技術(shù)和成像技術(shù)的進(jìn)步，難以用肉眼觀察到的微生物逐漸被人們所了解：比如，微生物的生物膜、菌落形態(tài)和構(gòu)成，微生物的侵染過程，甚至是分辨率要求更高的微生物亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位。通常情況下，在熒光成像設(shè)備的分辨率的角度來看，寬場(chǎng)熒光顯微鏡→激光共聚焦顯微鏡→較高分辨率熒光成像設(shè)備的分辨率依次提升，面對(duì)微生物這樣比動(dòng)物細(xì)胞小10倍以上的微生物，我們?cè)撊绾芜x擇合適的成像設(shè)備呢?通過下面三個(gè)案例，我們來看看不同設(shè)備下微生物的廬山真面目。
PNAS/微米尺度下的人類口腔微生物地理形態(tài)
微生物復(fù)雜的空間群落對(duì)于理解群落中各類群間的相互作用至關(guān)重要，本文引入為生物地理學(xué)的概念，研究微生物的分布與環(huán)境在微米尺度上的關(guān)系。借助DNA測(cè)序提供的不同類群豐富的基因組序列信息，研究人員利用熒光原位雜交技術(shù)同時(shí)標(biāo)記9種類群的微生物，通過激光共聚焦顯微鏡光譜成像，發(fā)現(xiàn)人類牙菌斑的多屬且高度組織化的微生物群落——獨(dú)特的“多屬聯(lián)合體”。共聚焦多層采集重構(gòu)出的3D結(jié)果顯示，聯(lián)合體尺寸從幾十微米到幾百微米不等，由一個(gè)放射狀排列的9個(gè)單元組成，絲狀、棒狀桿菌圍繞在其周圍。并且該聯(lián)合體呈現(xiàn)出單個(gè)類群空間排布的差異性：比如厭氧類群傾向于內(nèi)部定位，而兼性或?qū)Ｐ孕柩躅惾簝A向于排列在聯(lián)合體外部;代謝產(chǎn)物乳酸的生產(chǎn)者和消費(fèi)者往往彼此靠近等。豐富的結(jié)構(gòu)差異影響微生物的生理和生態(tài)特性，這為理解微生物組織、代謝和系統(tǒng)生物學(xué)提供了重要的空間模型和組織框架。
亮點(diǎn)：在可見光范圍內(nèi)選擇的多色熒光染料，分別標(biāo)記不同細(xì)菌，本文選擇9種熒光標(biāo)記，易出現(xiàn)串色，利用蔡司電子顯微鏡的光譜分光特性以及光譜拆分(點(diǎn)擊查看)，可以準(zhǔn)確區(qū)別9種標(biāo)記避免串色。同時(shí)，利用共聚焦良好的光切效果，進(jìn)行多層掃描獲得xyz三維立體數(shù)據(jù)，重構(gòu)菌落立體結(jié)構(gòu)。
牙菌斑中的“花椰菜”結(jié)構(gòu)，主要由樟腦菌屬、鏈球菌屬、嗜血桿菌/聚集菌和脈管菌組成，其中還分散排布普雷沃菌、羅西亞菌和噬帽菌。右圖：牙菌斑中復(fù)雜的“玉米芯”結(jié)構(gòu)。設(shè)備：LSM 780
通過光學(xué)多色成像數(shù)據(jù)，構(gòu)建的牙菌斑的刺猬狀菌落模型。鏈球菌和放線菌的生物膜上結(jié)合棒狀桿菌菌絲，在菌絲遠(yuǎn)端被球狀菌(鏈球菌、卟啉單胞菌等)包裹形成玉米穗狀結(jié)構(gòu)，叢生的奈瑟菌包圍在菌落外側(cè)。外側(cè)的細(xì)菌構(gòu)建了一個(gè)富二氧化碳低氧的環(huán)境，厭氧菌在內(nèi)部生長(zhǎng)。
細(xì)胞焦亡是一種機(jī)體在感知病原微生物侵染后啟動(dòng)的免疫防御反應(yīng)，本質(zhì)上是一種程序性細(xì)胞壞死，它的表現(xiàn)為細(xì)胞膜形成孔洞、逐漸膨脹至細(xì)胞膜破裂等，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物釋放并引起劇烈的炎癥反應(yīng)。細(xì)胞焦亡又分為經(jīng)典與非經(jīng)典通路，在非經(jīng)典通路中，以細(xì)菌脂多糖(LPS)為例，前人研究表明它不需要借助受體就可以直接進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，進(jìn)而使LPS受體——Caspase 家族成員發(fā)生寡聚而活化，切割gasdermin-D，誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡的發(fā)生。本文研究則發(fā)現(xiàn)，宿主細(xì)胞中的GBP1起到細(xì)菌脂多糖(LPS)感受器的作用，通過靜電作用高親和結(jié)合沙門氏菌表面的LPS，并且通過招募GBP2-4組裝成GBP coat，進(jìn)一步促進(jìn)capspase-4募集于細(xì)菌表面并發(fā)生活化，證實(shí)細(xì)菌脂多糖膜的活化使開啟非經(jīng)典炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的一步。
亮點(diǎn)：直徑2-3um的沙門氏菌，通過蔡司共聚焦上搭載的較高分辨設(shè)備Airyscan(點(diǎn)擊查看)，有效實(shí)現(xiàn)2倍分辨率提升，清楚定位GBPs在細(xì)菌表面(類似膜結(jié)構(gòu)的成像效果)的結(jié)合和募集。
沙門氏菌(rsRED標(biāo)記，紅色)侵染Hela細(xì)胞，胞內(nèi)的非典型炎癥小體GBP1(eGFP標(biāo)記，綠色)結(jié)合沙門氏菌表面。細(xì)胞核(Hoechst標(biāo)記，藍(lán)色)，標(biāo)尺：10um(C)5um(F)。設(shè)備：LSM 800 with Airyscan。
亮點(diǎn)：利用普通的激光共聚焦觀察直徑僅有2um左右的大腸桿菌，可以看到其棒狀形態(tài)，但很難看到其內(nèi)部的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，所以作者利用 蔡司電子顯微鏡較高分辨成像系統(tǒng)Elyra(點(diǎn)擊查看)(SIM分辨率: xy 120nm，z 300nm)對(duì)進(jìn)行亞細(xì)胞定位的3D成像，可以清晰看到IRGB10位于大腸桿菌DNA與LPS之間的獨(dú)特的結(jié)構(gòu)位置。
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